科研 |Int. J. Biol. Macromol.：UPLC-HDMSE可用于发现成人1型糖尿病的血清生物标志物

 点击蓝字“蛋白质组”,轻松关注不迷路

生科云网址：https://www.bioincloud.tech/

---

编译：微科盟-草重木雪，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

1型糖尿病(T1D)是一种复杂的疾病，具有可以改变个体蛋白质组的代谢和功能变化。HDMS^E系统中的LC-MS/MS分析方法被用于鉴定T1D患者和健康对照的高丰度蛋白耗尽血清中的差异表达蛋白。样品在Progenesis QI for Proteomics软件中进行处理。我们使用Gene Ontology和ToppGene对蛋白质进行功能富集，并通过STRING 11.5显示相互作用。结果共鉴定出139种蛋白质，其中14种在T1D患者的血清中与对照组相比下调。大多数差异表达的蛋白质被证明与免疫系统、炎症和生长激素刺激反应有关，并且与T1D的进展有关。差异蛋白表达数据首次显示T1D患者血清中CPN2表达水平的变化。我们的研究结果表明，这些蛋白质是未来研究和验证T1D蛋白质生物标志物的靶点。

论文ID

原名：UPLC-HDMS^E  to discover serum biomarkers in adults with type 1 diabetes译名：UPLC-HDMS^E在成人1型糖尿病中发现血清生物标志物期刊：International Journal of Biological MacromoleculesIF：8.025发表时间：2022.09通讯作者：Valeria C. Nogueira
通讯作者单位：巴西Federal Institute of Ceará (IFCE)

实验设计

实验结果

1. 患者与对照组的特性
平均年龄为33.70 ± 8.46岁的10名受试者被分为两组：1型T1D患者（n = 5）和对照组（n = 5）。T1D和对照组相匹配，在性别、年龄、BMI、总胆固醇、HDL-C、LDL-C、总蛋白和尿素方面没有显著差异。正如预期的那样，T1D患者与对照组的空腹血糖和C肽存在显著差异（分别为p = 0.016 和 p = 0.008），T1D患者空腹血糖浓度较高，C肽浓度较低。肌酐也有显著差异（p = 0.047）。各组的人体测量学和生化特征见表1。表1 1型糖尿病患者和对照组的人口统计学、人体测量学和临床特征注：值表示为平均值(SD)和数字(百分比)。_a学生t检验；_b Mann-Whitney。p值< 0.05被认为具有统计学差异。缩写：T1D（1 型糖尿病）；BMI（体重指数）； WC（腰围）；WHR（腰臀比）；HbA1c（糖化血红蛋白）；低密度脂蛋白（低密度脂蛋白）；HDL（高密度脂蛋白）。
2. 差异表达蛋白的鉴定
我们共鉴定出139种蛋白质（补充表1），其中14种蛋白质在T1D组的血清中与对照组相比差异表达。所有蛋白质均被下调：补体 C3 (C3)、羧肽酶N亚基2 (CPN2)、间α-胰蛋白酶抑制剂重链 H4 (ITIH4)、凝血酶原 (F2)、血管紧张素原 (AGT)、凝溶胶蛋白 (GSN)、血清淀粉样蛋白P成分(APCS)、胰岛素样生长因子结合蛋白复合体酸不稳定亚基(IGFALS)、α-1-酸性糖蛋白1 (ORM1)、α-1-酸性糖蛋白2 (ORM2)、人源性激肽释放酶结合蛋白(SERPINA4)、载脂蛋白B (APOB)、载脂蛋白E (APOE)和铜蓝蛋白(CP)（表2）。图1 用于鉴定1型糖尿病患者和对照组血清中差异表达蛋白质的研究设计示意图
鉴定出的蛋白质参与了14种不同的生物过程，包括细胞过程(19 %)、生物调节(16.7 %)、代谢过程(16.7 %)、对刺激的反应(10.9 %)、定位(7.8 %)、免疫系统过程(6.8 %)和信号传导(5.8 %)等等。考虑到分子功能，一些蛋白质富集了结合（45.9%）、催化活性（31.5%）、分子功能调节剂（15.3%）和其他功能（图2）。表2 与对照组相比，在1型糖尿病患者的血清中鉴定和差异表达的蛋白质的特征，通过Synapt G2-Si 质谱仪中的Acquity UPLC M-Class分离蛋白质组学分析确定注：倍数变化（1 型糖尿病患者与对照组的比率）；Log2 (FC)（倍数变化对数值）；方向（蛋白质差异表达上调或下调）；p值（p < 0.05 被认为具有统计学意义）。
考虑到差异表达的蛋白质，ToppGene平台显示了一些涉及大多数蛋白质的功能。在生物学过程中，蛋白质C3、CPN2、ITIH4、F2、AGT、GSN和APCS在免疫和炎症系统中发挥着重要作用。IGFALS、ORM1和ORM2蛋白表现出对生长激素刺激的反应以及ORM1、ORM2和SERPINA4蛋白在血小板脱粒中的作用。APOB和APOE在脂蛋白代谢中起作用。在分子功能方面，蛋白AGT、APOE、CPN2、C3、F2、ITIH和SERPINA4显示出酶的调节活性，蛋APCS、APOB、APOE、C3、F2和GSN脂质结合功能和CP氧化还原酶和氧化铁酶活性。大多数蛋白质（AGT、APCS、APOE、CP、C3、F2、GSN和ORM1）与T1D的发展有关（补充表2）。图2 基于研究中鉴定的总蛋白质的分子功能(A)、生物过程(B)和细胞成分(C)的富集分析(GO)进行蛋白质分组
我们基于使用差异表达蛋白质的STRING分析生成的网络（IGFALS、GSN、APCS、CPN2、APOE、ORM2、ITIH4、C3、F2、CP、APOB、AGT、SERPINA 4和ORM1），所有蛋白质都显示出相互作用并在计算机上确定（图3）。图3 与对照组相比，使用STRING对1型糖尿病患者的差异表达蛋白质进行网络分析注：PDB id 2kc3：载脂蛋白E（STRING id APOE/P02649）；PDB id 2jdq：载脂蛋白B（STRING id APOB/P04114）；PDB id 2wxw：血管紧张素原（STRING id AGT/P01019）；PDB id 5zln*：胰岛素样生长因子结合蛋白复合酸不稳定亚基（String id IGFALS/P35858）； PDB id 1nl1*：凝血酶原（STRING id F2/P00734）；PDB id 2ol2：人源性激肽释放酶结合蛋白（String id SERPINA4/P29622）； PDB id 3apu：α-1-酸性糖蛋白2（String id ORM2/P19652）；PDB id 3kqo：α-1-酸性糖蛋白1（String id ORM1/P02763）；PDB id 2win:间α胰蛋白酶抑制剂重链H4 (String id ITIH4/Q14624)；PDB id 2a3w：血清淀粉样蛋白P成分（String id APCS/P02743）；PDB id 4enz：铜蓝蛋白（String id CP/P00450）；PDB id 2a0z：羧肽酶 N亚基2（String id CPN2/P22792）； PDB id 4pkh：凝溶胶（String id GSN/P06396）； PDB id 4hw5：补体成分C3（String id C3/P01024）。*在智人中无法识别。

讨论

T1D是一种慢性疾病，在大多数情况下治疗方法是在缺乏对分子理解的情况下发展起来的。因此，蛋白质组学分析代表了一种相关工具，用于识别可用于诊断、治疗技术指示和疾病演变跟踪的生物标志物。本研究使用蛋白质组学方法和UPLC-HDMS^E分析来探索T1D患者与对照组相比的血清蛋白。共有14种蛋白质被鉴定为差异表达，所有这些蛋白质都被下调。ToppGene富集分析证实，大多数蛋白质显示出与T1D相关的明显趋势。下面将讨论差异表达的蛋白质。
1. 免疫和炎症系统
在鉴定的蛋白质中，C3、ITIH4、CPN2、F2、AGT、GSN和APCS在涉及免疫和炎症系统的ToppGene富集分析中显示出生物学功能。当这些蛋白质用String数据库可视化时，我们在过滤后观察到C3和ITIH4之间以及C3和CPN2之间的连接以获得高置信度（String交互得分高于 0.7）。C3是补体系统的中枢急性期蛋白，对炎症反应、细胞和组织稳态具有作用。合成补体系统蛋白的缺陷会导致补体稳态功能障碍，加剧自身免疫性疾病的发展。有趣的是，补体系统的调控不足和过度激活可以证明体内的炎症过程和组织损伤。先前的研究表明，C3补体在DM进展中的矛盾作用取决于其活动的性质和分析部位。一方面，C3蛋白与凝块的结合增加会损害纤维蛋白溶解，从而降低糖尿病患者血栓形成的风险。另一方面，血清和血浆C3水平升高与人类胰岛炎症、胰岛素抵抗、糖尿病高发病率、糖尿病慢性并发症和T1D个体代谢调控不佳有关。其他研究报告了DM1患者的C3水平降低。此外，补体系统的先天功能在面对高血糖状况时会受损，例如调控不佳的糖尿病，使个体更容易感染。因此，本研究中观察到的蛋白C3表达降低表明补体系统功能障碍可能会损害其在调控T1D中的某些功能。ITIH4是一种急性期反应血浆糖蛋白，具有丝氨酸蛋白酶抑制功能和抗炎作用。除了与心脏代谢疾病、类风湿性关节炎和T1D相关外，这种蛋白质还与DM患者发生肾功能衰竭和进行性肾病的风险相关。Gourgari等人证明，由ITIH4基因编码的蛋白质在T1D调控不佳的患者的HDL蛋白质组中升高，在达到血糖控制目标后很快受到调节。另一方面，在鉴定与T1D进展相关的基因时，Prashanth等人证明ITIH4在T1D患者的血清中含量较低，支持本研究的结果。然而，作者并未确定样本的血糖特征，我们研究中T1D个体良好的血糖调控可能与ITIH4的较低表达有关。在这项研究中，我们发现CPN2在T1D患者血清中的表达降低。这种蛋白质通常被认为是一种酶，它可以使可促进炎症反应的肽（如激肽、过敏毒素和肌酸激酶）失活，从而调节炎症和血管张力。CPN2已被鉴定为在患有急性心肌梗塞 (MI)的个体的血浆中高表达，并作为动脉粥样硬化的生物标志物。Mendoza报告说，在MI中观察到的CPN2表达升高可能是机体试图限制补体激活和抑制炎症。事实上，在目前的分析中，通过ToppGene进行富集后，CPN2与冠状动脉疾病相关。然而，据我们所知，目前没有发表的关于CPN2与T1D的研究，这使得我们的研究结果非常有价值。因此，本研究中观察到的CPN2下调可能会损害其在调节T1D炎症和血管张力中的作用。然而，需要更多的研究来证实这一假设。我们在F2蛋白和AGT之间发现了强烈的相互作用。根据ToppGene富集，两者都与心血管疾病、高脂血症、肾病综合征和T1D的发病有关。F2被凝血酶复合物激活到血管损伤部位的凝血酶。凝血酶的作用是切割纤维蛋白原，导致血凝块的形成，其突变会增加发生深静脉血栓形成的风险。高血糖与凝血酶合成增加有关，调控血糖水平可减少凝血酶生成，这表明高血糖可促进血栓形成。T1D患者血清的蛋白质组学分析显示F2蛋白水平随表达增加，证实这种蛋白质可提示糖尿病调控不佳。相反，我们的研究显示F2蛋白的低表达，这可能反映了T1D患者良好的血糖控制。AGT对肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)至关重要，在血压稳态、调控心血管疾病方面具有关键作用，并且还与DM相关。然而，在存在代谢紊乱的情况下，AGT会因DM中存在的高血糖而增加，导致肾内血管紧张素II的形成，这可能导致钠潴留，从而导致高血压和肾损伤的发展。然而，在T2D病因学中使用AGT多态性的研究显示，关于AGT多态性与DM存在的关系的结果存在分歧。目前的研究加强了这种蛋白质与DM的关联，AGT的低表达可能有助于降低T1D患者发生动脉粥样硬化疾病的风险。GSN和APCS是参与免疫和炎症系统的蛋白质的成员。研究报告称，细胞质凝溶胶蛋白(cGSN)可促进肌动蛋白重塑并改善胰腺β细胞的功能、存活和凋亡延迟。另一方面，血浆凝溶胶蛋白(pGSN)调节肌动蛋白丝的完整性。cGSN和pGSN水平升高可通过促进胰腺β细胞分泌胰岛素来更好地调控血糖。Khatri报告了较高的血糖水平和降低的pGSN值之间的正相关关系。在这项研究中，我们观察到GSN的低表达。其他研究证实了我们的研究结果，表明血清和尿中GSN水平分别与T1D和糖尿病肾病有关。APCS是先天免疫的一个组成部分，参与抵抗细菌感染和通过抑制纤维细胞分化来调节组织重塑。此外，它在炎症调节中具有重要作用。有报道表明，患有糖尿病和高水平APCS的人的愈合过程较慢，高血糖症的存在也加剧了这种情况。在实验研究中，血浆APCS表达增加被认为是T1D的一个可能指标，用从豆粕中分离的降血糖循环二肽(His-Pro) (CHP)处理后降低。此外，APCS血清水平的降低导致成人动脉粥样硬化和炎症过程的风险降低。在T1D患者中较低的APCS表达可能会抑制T1D中存在的炎症。
2. 细胞对生长激素刺激和血小板脱颗粒的反应
ToppGene进行的功能富集表明，IGFALS、ORM1和ORM2蛋白显示出对生长激素刺激的细胞反应，而ORM1、ORM2和SERPINA4蛋白显示出血小板脱粒功能。IGFALS具有通过编码酸不稳定亚基(ALS)来调节胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)的生物利用度、干扰生长、正常发育和代谢调节以及葡萄糖代谢的作用。有证据表明，携带IGFALS基因突变的个体可能是糖尿病的高危人群，IGFALS蛋白缺乏可能会干扰IGF-1的生物利用度并增加胰岛素抵抗。Gutefeldt和Fukui证实了我们的研究结果，发现T1D成人的IGF-1血浆水平较低。此外，他们表明，较低的C肽值与较低水平的IGF-1相关。我们的研究结果表明，IGFALS蛋白的低表达可能与T1D的发展有关，需要进一步的研究来证实IGFALS在这种疾病中的表现。ORM2与ORM1在人ORM (类粘蛋白，ORM)的调控中有很强的关联性，这在蛋白之间通过STRING的相互作用中得到了证实。它是一种急性期炎症蛋白，T1D时血清和尿ORM水平升高可能反映内皮功能障碍和动脉粥样硬化。研究表明ORM作为与T1D和T2D肾功能下降相关的尿液生物标志物。此外，在T1D和增生性视网膜病变患者的尿液中，ORM1表达上调。因此，在我们的T1D患者中发现的ORM1和ORM2的血清低表达可能表明某些DM并发症进展的风险较低。SERPINA4在抑制炎症、氧化应激、纤维化和血管生成方面很重要。SERPINA4缺乏会增加器官损伤、氧化应激、炎症和纤维化，并且在患有肝病和糖尿病视网膜病变等疾病的个体中明显更缺乏。另一方面，高水平的SERPINA4会损害愈合，促进慢性缺氧，并改变肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统之间的平衡，从而损害肾脏健康。高血糖可能是SERPINA4增加的主要因素之一。总体而言，研究表明，与无并发症的DM患者和对照组相比，T1D或T2D患者和糖尿病慢性并发症患者的血清SERPINA4水平升高，这表明存在代偿机制。除了与视网膜、肾脏、血管损伤、炎症和血糖呈正相关外。在本研究中，T1D患者血清蛋白质组中SERPINA4的表达较低，这可能受到更好的血糖调控的影响。然而，这种蛋白质的上调可能表明这些个体的器官损伤和炎症过程增加。
3. 脂蛋白代谢
本研究确定了参与脂蛋白代谢的两种载脂蛋白APOB和APOE。APOB和APOE蛋白之间的关系在STRING平台执行的交互中很明显。APOB是乳糜微粒、乳糜微粒残留物、极低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、LDL和脂蛋白(a)的主要成分之一，可用于评估致动脉粥样硬化的脂质状态。较多证据表明，升高的APOB是DM和心血管疾病的准确风险指标。事实上，T1D患者经常出现脂质紊乱，如潜在致动脉粥样硬化脂蛋白的质性和功能异常。然而，当疾病未得到控制时，APOB-100的增加更为常见，而T1D的质性脂质异常主要发生在血糖异常的环境中。Li等人将APOB-100确定为T2D患者的血清生物标志物，高水平的APOB可能表明高浓度的致动脉粥样硬化颗粒与胆固醇含量无关。此外，文献表明营养和非营养因素可以影响APOB的增加。我们的结果支持先前的研究，显示APOB在调节脂质代谢中的作用。APOE在HDL的形成中起重要作用，影响胆固醇的逆向转运，在胆固醇和甘油三酯的代谢、转运和消化过程中必不可少。APOE在HDL的形成中起重要作用，影响胆固醇的逆向转运，在胆固醇和甘油三酯的代谢、转运和消化过程中必不可少。Karimoei等人在研究APOE多态性参与T2D个体时，发现APOE4等位基因在糖尿病肾病中具有保护作用。另一方面，APOE4等位基因的存在与T1D、T2D和心血管疾病(CVD)的风险增加相关，支持APOE多态性与DM中存在CVD的关联。此外，APOE水平的降低可以减少LDL胆固醇的转运，增加循环中的胆固醇和甘油三酯水平。因此，在T1D个体中观察到的APOE表达较低提示有发生CVD的风险。
4. 对营养水平和细胞外刺激的反应
尽管文献中没有明确定义其生物学作用，但CP蛋白可能具有由高血糖诱导的促氧化功能，并可能有助于铜转运、铁代谢和抗氧化防御。一些研究报告DM患者血浆和血清中CP蛋白水平升高，证实了该蛋白在与炎症密切相关的代谢疾病中的作用。此外，我们在T2D受试者中观察到空腹血糖、疾病持续时间和血浆CP水平之间呈正相关。另一方面，空腹血糖与血清CP水平在T1D和T2D个体中呈负相关，CP的降低可能是由于蛋白质糖基化的增加。Silva等人证明CP的血清水平在T1D患者中表现出增加的表达，而与血糖控制无关。在这项研究中，T1D患者的CP下调可能是由于增加使用抗氧化剂（例如CP本身）来中和该疾病中过量合成的活性氧物质。
5. 差异表达蛋白之间的相互作用
STRING说明了差异表达蛋白质之间的一些相互作用。在这些相互作用中，只有IGFALS和CPN2与ToppGene中的T1D无关。然而，一些研究报告了IGFALS和T1D之间的关联，尽管没有发现将CPN2和T1D联系起来的报告。这种相互作用最有趣的方面可能是CPN2和C3之间存在密切关系，C3是一种与T2D和T1D相关的蛋白质，尽管之前没有研究将CPN2蛋白与T1D相关联。
6. 研究局限性
本研究具有优势和一些局限性。首先，值得注意的是，它是一种研究T1D个体蛋白质组学特征的方法，很少有研究用这种类型的分析研究T1D。此外，所使用的方法是具有高灵敏度和特异性的最先进的质谱法。事实上，主要限制是我们分析中使用的样本量小，这使得用更大的队列验证本研究中发现的结果变得很重要。尽管如此，样本的选择是通过配对性别、年龄、BMI、WC、WHR、总胆固醇、LDL-c、HDL-c、总蛋白和尿素来进行的，以形成更均质的组。

结论

在本研究中，我们使用高通量、高分辨率的蛋白质组学策略来鉴定T1D患者和对照血清中差异表达的血清蛋白。与对照组相比，我们发现14种蛋白质在T1D患者的血清中下调。大多数这些蛋白质是由其他研究人员鉴定的，并有助于参与DM发展的机制，支持这种蛋白质组学方法的可重复性。此外，据我们所知，我们描述了T1D患者血清中CPN2表达水平变化的第一个证据。最后，这项研究表明蛋白质是了解T1D所涉及的分子机制的潜在靶点。然而，我们应该进行进一步的研究来调查和验证这些蛋白质是否可作为T1D患者的血清生物标志物。原文链接：  https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36115450/

----------微科盟更多推荐---------- 

      

如果需要原文pdf，请扫描文末二维码领取

请关注下方公众号

了解更多蛋白质组知识

蛋白质组，专注蛋白质组学《蛋白质组》是微科盟旗下专注于学术知识免费分享平台，内容主要包括分享蛋白组学最新文献，新闻，干货知识，视频课程和学术直播讲座。

蛋白质组仅用于学术成果分享与交流，不涉及商业利益。

也严禁他人将本公众号的内容用于商业运营。